NDM-1 Gene Spreading to Multiple Bacteria Species, Making Them Antibiotic-Resistant

Alice Goodman

September 22, 2010 (Boston, Massachusetts) — The gene that encodes for New Delhi metallo-beta-lactamase-1 (NDM-1), which confers resistance to most currently available antibiotics, appears to be spreading from the Indian subcontinent (India, Pakistan, and Bangladesh), researchers reported here at a media press conference during the 50th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (ICAAC).
NDM-1 has recently been documented in strains of bacteria in Australia, France, Japan, Kenya, North America, Singapore, Taiwan, and the United Kingdom. The emergence of this gene poses the threat of a pandemic with few treatment choices, said researchers.
In 2 separate reports at ICAAC, investigators described cases of NDM-1 in Escherichia coli in Canada and in Klebsiella sp. in Australia, prompting the news conference. Both case reports involved patients who had recently traveled to India. No one really knows the true prevalence of NDM-1-infiltrated bacteria, the researchers said, but they believe that the spread from India to other parts of the world is at least partly due to a confluence of a large Indian diaspora returning to their homeland for visits and to the phenomenon of medical tourism to India.
"The reservoir is in India, Pakistan, and Bangladesh, and is due to factors that are not controllable — overuse of antibiotics, poor hygiene, and diarrhea in an overcrowded overpopulated country. A plague could spread around the world, first through the Indian diaspora, which constitutes 20 million people all over the world," warned Patrice Nordmann, MD, from the Hôpital de Bicêtre, Le Kremlin-Bicêtre, France. "We feel it's only a question of time." Dr. Nordmann was a panelist at the press conference.
It is not known how widespread NDM-1 is in India, "which is one of our greatest concerns," added Timothy Walsh, MD, from Cardiff University in the United Kingdom.
"Our data are not accurate, but there are billions of people in India without clean water and sanitation. Massive antibiotic usage and antibiotics in the sewage create a nightmare that is a perfect recipe. Selective pressure fuels antibiotic resistance, and bugs are put on hyperdrive to accept DNA with NDM-1 encoded in plasmids," Dr. Walsh said.
Since the abstracts describing the 2 case reports of NMD-1-associated resistance were submitted to the ICAAC, other cases have emerged in Australia and Canada. Culture of the infection in Canada revealed the same strains of NMD-1 E coli identified in the United Kingdom and India. In the Australian case, NDM-1 was present in Klebsiella pneumoniae isolated from a foot wound.
"Both patients in Canada were treated successfully, but according to lab tests, only 3 antibioticswere found to have any effect — tigecycline, colistin, and phosphomycin," said senior author of that abstract, Johann Pitout, MD, from the University of Calgary in Alberta.
Perhaps more important is the fact that general practitioners are not used to seeing multidrug resistance associated with NDM-1, and if this type of infection does become common, infected patients may not get appropriate treatment, Dr. Pitout stated. "General practitioners are not qualified to treat these infections," he asserted.

Antibiotic Prescribing Habits Have Shifted According to Pathogen Prevalence Patterns

Alice Goodman

September 22, 2010 (Boston, Massachusetts) — The choice of which antibiotic to prescribe as initial empiric therapy for hospitalized patients with complicated skin and skin-structure infections has changed substantially over the past decade, suggesting that physicians are responding to an increase in methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Pseudomonas aeruginosa, and Gram-negative infections in general. Multidrug use is also much more common than it was 10 years ago, according to a retrospective study reported here at the 50th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy.
The use of vancomycin — the most widely used drug for MRSA — increased dramatically, whereas the use of cefazolin and ampicillin/sulbactam — 2 drugs used to treat methicillin-susceptible S aureus — declined over the same period. Concomitantly, a marked increase was seen in prescribing pipericillin/tazobactam, a broad-spectrum antibiotic covering Gram-negative infections.
"These changes in initial antibiotic therapy in hospitalized patients undoubtedly reflect increasing concern about pathogen resistance and changes in treatment guidelines. Our objective was to see whether physicians are responding to the changing environment in infectious disease, and our study suggests that they are," said senior author David Weber, MD, professor of medicine, pediatrics, and epidemiology at the University of North Carolina in Chapel Hill.
The study used the Cerner Health Facts electronic database to identify 22,832 adult patients hospitalized for complicated skin and skin-structure infections in the United States between 2000 and 2009; 75% were hospitalized for acute infections, 18.3% for infections at the surgical site, and 6.6% for chronic infections.
A marked decrease over time was observed in the use of cefazolin (from 22.1% to 6.9%) and ampicillin/sulbactam (from 19.9% to 6.0%), whereas the use of vancomycin increased 4-fold (from 5.6% to 22.6%), and the use of piperacillin/tazobactam plus vancomycin increased more than 10-fold (from 0.9% to 12.9%. Piperacillin/tazobactam monotherapy increased more than 2-fold (from 2.8% to 6.5%).
Dr. Weber pointed out that the use of vancomycin as either a single agent or as part of a multidrug regimen increased from 16.5% in 2000 to 55.4% in 2009. During that time period, the use of piperacillin/tazobactam either as a single agent or as part of a multidrug regimen increased from 6.8% to 20.9%.
Over the same time period, the use of initial regimens providing coverage for P aeruginosa increased from 16.4% to 28.1%, and antibiotic regimens providing broad-spectrum coverage for Gram-negative infections increased from 22.1% to 36.1%.
Dr. Weber cited several limitations of this study: its retrospective design, the fact that its database might not be generalizable to all American hospitals, and the fact that it provided no information on why initial antibiotics were selected.
Commenting on this study, Vance Fowler, MD, associate professor at Duke University in Durham, North Carolina, said: "Multidrug-resistant pathogens are on the rise in critically ill patients who present to the hospital with life-threatening complications of skin and skin-structure infections. We want to make sure we are choosing antibiotics wisely."
"Physicians have to make an educated guess during the first 24 hours of hospitalization, and they get points for being right. You know antimicrobial resistance is climbing in the hospital setting, and your job is to ensure that the patient in the bed right now has the best chance to get the best therapy out of the gate," he continued.
"This study implies physicians are doing their job," Dr. Fowler stated.
Dr. Weber reports receiving financial support from Policy Analysis Inc and the Forest Research Institute of New York City. Dr. Fowler reports financial ties with Astellas, Cubist, Merck, Theravance, Pfizer, Novartis, Inhibitex, Arpida, Targanta, Wyeth, Ortho-McNeil, Vertex Pharmaceuticals, Leo Pharmaceuticals, NovaDigm, The Medicines Company, Baxter Pharmaceuticals, Biosynexus, and Johnson & Johnson.
50th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (ICAAC): Abstract L1-1761. Presented September 14, 2010.

BIOSÍNTESIS DEL PEPTIDOGLICANO

www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/05paredbios.htm
1 INTRODUCCIÓN
En el capítulo anterior estudiamos la composición química, estructura y funciones de los principales tipos de paredes celulares procarióticas. En este capítulo trataremos un aspecto dinámico del tema de las paredes: cómo se sintetiza el peptidoglucano de las eubacterias, y cómo se produce el proceso general de crecimiento de la pared, incluyendo el evento particular de formación del septo transversal que marca el “nacimiento” de dos células hijas. Nos concentraremos en la biosíntesis del peptidoglucano, debido a su interés intrínseco y aplicado (sobre este proceso actúan diversos antibióticos, algunos de gran importancia clínica).
Desde el punto de vista topológico, todas las capas de las envueltas bacterianas (membranas, pared celular) son superficies cerradas sobre sí mismas, físicamente continuas para mantener la integridad y viabilidad de la célula.
Pero por otro lado, deben de ser susceptibles de expandirse durante el crecimiento por incorporación de nuevos materiales. Además, todos los constituyentes deben crecer coordinadamente e incorporarse en los lugares precisos. Por ejemplo, en el caso de las bacterias Gram-negativas, distintos componentes deben de ir a parar a diferentes localizaciones: periplasma, PG, membrana externa, e incluso medio exterior.
Durante cada ciclo celular, hay una fase en la que los materiales de las envueltas (y concretamente, de la pared celular que nos ocupa ahora) deben de facilitar la división de la célula en una descendencia de dos células hijas.
Finalmente, queda el problema de la energía. Los procesos biosintéticos requieren aporte de energía química, pero el ATP y compuestos similares no pueden salir del protoplasto.
Precisamente en este capítulo vamos a ver algunas de las estrategias bioquímicas y moleculares que las bacterias han evolucionado para solventar estos puntos para el caso del peptidoglucano. Veremos que la estrategia implica varias fases:
*Síntesis de precursores en el citoplasma
*Ensamblaje parcial en membrana
*Transporte a la cara externa externa de la membrana
*Ensamblaje final en el exterior, mediante reacciones que no precisan energía
2 BIOSÍNTESIS DEL PEPTIDOGLUCANO DE MUREÍNA
Consta de 4 etapas:
1.Síntesis de precursores solubles en el citoplasma.
2.Estos precursores son transferidos a un transportador lipídico situado en la membrana citoplásmica (un poliisoprenol fosfatado llamado undecaprenil-fosfato), donde se forman las unidades disacarídicas con el pentapéptido.
3.Las unidades disacarídicas se polimerizan en cadenas lineales fuera de la membrana, pero aún unidas al undecaprenil-fosfato de la membrana.
4.Unión del polímero lineal así formado al peptidoglucano preexistente en la pared celular, por entrecruzamiento de (al menos) parte de sus péptidos respectivos.
A estas etapas hay que añadir una fase adicional de regeneración del transportador lipídico, una vez que ha cumplido su misión, para que pueda ser operativo en un nuevo ciclo de síntesis.
Veamos, pues, en más detalle, cómo ocurre este interesante proceso:
Fase 1:. Los monosacáridos que luego van a constituir la unidad disacarídica repetitiva del esqueleto del peptidoglucano (NAM y NAG) se activan al unirse a uridín difosfato (UDP). (En general, los monosacáridos que han de incorporarse a polímeros de pared celular bacteriana se activan mediante su unión con nucleósidos-fosfato.)
Por lo tanto, en esta fase se sintetizan por separado:
NAG-UDP
NAM-UDP
Luego se va produciendo la adición secuencial y ordenada de los distintos aminoácidos al NAM (en reacciones que requieren energía e iones Mn++):
1. L-ala
2. D-glu
3. m-DAP (u otro diaminoácido; p. ej. L-lys en Staphylococcus aureus)
4. D-ala-D-ala
Observar que no se produce un tetrapéptido, sino un pentapétido. El último paso de adición de aminoácidos es la unión del dipéptido D-alanil-D-alanina, que se ha sintetizado en dos fases:
una racemasa convierte la L-ala a D-ala;
creación de enlace peptídico entre dos D-ala.
Fase 2: El UDP-NAM-pentapéptido se transfiere ahora a un transportador de membrana, llamado undecaprenil-fosfato (que abreviaremos como Lip-P), en una reacción catalizada por una translocasa específica.
El undecaprenil-fosfato es un poliisoprenoide de 55 átomos de C (C55, derivado de la repetición 11 veces de la unidad isoprenoide, con un fosfato terminal). Se le conoce también con el nombre de bactoprenol, pero hoy se sabe que no es exclusivo de bacterias. El bactoprenol permite el transporte y ensamblaje de sustancias que, como los azúcares, son hidrofílicas, y no podrían pasar por sí mismas la barrera hidrofóbica de la membrana.
Una vez que el NAM-pentapétido está unido al undecaprenil (por medio de pirofosfato), una transferasa transfiere a éste la NAG desde el UDP-NAG. Se genera pues el enlace ß(1à4) entre NAG y NAM. Por lo tanto, se obtiene: Lip-P-P-NAM(pentapéptido)-NAG.
En esta situación es cuando se producen la modificaciones que ya estudiamos en la estructura básica del PG. Por ejemplo: en Staphylococcus aureus el grupo -COOH del D-glutámico en posición (2) es amidado (pasa a --CO-NH2. Por otro lado, se introducen los puentes peptídicos, que en el caso de esta bacteria consisten en una pentaglicina, que se une al grupo amino terminal de la L-Lys en posición (3).
Tanto la traslocasa como la transferasa está localizadas en el lado citoplásmico de la membrana, de modo que el precursor Lip-P-P-NAM(pentapéptido)-NAG, en este momento está “colgando” hacia el citoplasma, anclado a la lámina interna de la membrana a través de bactoprenol.
Fase 3: Polimerización de varias unidades disacarídicas: Ahora el bactoprenol “se da la vuelta” en la membrana (una especie de flip-flop desde la capa interna hasta la externa), de modo que logra que el precursor resultante de la fase 2 quede expuesto hacia el medio acuoso exterior a la membrana. Entonces tiene lugar la polimerización de varias unidades disacarídicas: ello se logra en una reacción de transglucosidación. Consiste en la unión de cada unidad disacarídica (con su pentapéptido) unida a su respectivo Lip-P-P, con el extremo libre (reductor) de una cadena preexistente que a su vez está unida a otra molécula de Lip-P-P.
En el proceso se libera uno de los Lip-P-P (o sea, el undecaprenil, pero en forma pirofosforilada). Sobre este Lip-P-P actúa una fosfatasa específica, que elimina el fosfato terminal, regenerándose el undecaprenil-fosfato, que queda dispuesto para otro ciclo como el descrito.
Fase 4: El polímero surgido de la fase anterior es una cadena lineal de PG sin entrecruzar, y unido aún al transportador lipídico de membrana. Ahora este polímero naciente (con sus pentapéptidos) reacciona, por transpeptidación, con un PG aceptor preexistente. En esta reacción se ven implicados el grupo C=O de la D-ala (4) del PG naciente y el grupo -NH2 libre del diaminoácido (3) del PG aceptor (o del último aminoácido del puente peptídico).
Esto es lo mismo que decir que el enlace peptídico entre D-ala (4) y D-ala (5) del PG naciente se ve sustituido por otro enlace peptídico, entre dicha D-ala (4) y el diaminoácido del PG naciente.

La energía para esta reacción la suministra la hidrólisis concomitante del enlace peptídico entre las dos D-ala terminales. Es decir, en cada reacción de transpeptidación se libera una D-ala, correspondiente a la que ocupaba la posición (5).
Ya dijimos en el capítulo anterior que no todos los tetrapéptidos participan en entrecruzamientos. Las D-ala terminales (en 5) de los péptidos no implicados en tales entrecruzamientos son eliminadas por una enzima llamada D-D-carboxipeptidasa. Esta enzima explica no sólo que en el PG maduro existan tetrapéptidos (y no los pentapéptidos originales), sino también la existencia de tripéptidos.
Muchas bacterias controlan el grado de entrecruzamiento de su PG maduro. Incluso algunas pueden eliminar totalmente muchos de los péptidos originalmente unidos al NAM, mediante enzimas conocidas genéricamente con el nombre de autolisinas. Así por ejemplo, Micrococcus luteus -un coco Gram-positivo- merced a su actividad NAM-L-ala-amidasa, presenta un PG que no está entrecruzado en un 50-70%.
Antibióticos que actúan a nivel de la biosíntesis de peptidoglucano:
Estos antibióticos tienen un efecto bactericida sobre bacterias en crecimiento. Ello se debe a que, al inhibir determinados pasos del ciclo de síntesis y ensamblaje del PG, provocan la acumulación de precursores de dicho PG, lo que a su vez desencadena la activación de las autolisinas de la bacteria, que degradan el PG y que finalmente provoca la lisis celular (en medios hipotónicos), por entrada masiva de agua a la célula.
1.Fosfomicina: actúa inhibiendo la formación del 3-O-D-lactil-éter de la NAG (o sea, del NAM). Parece ser que la base molecular estriba en la semejanza estructural entre el este antibiótico y el PEP (es decir, la fosfomicina es análogo estructural del PEP, lo que lleva a la inactivación de la enzima correspondiente a esta reacción).
2.Cicloserina: Se comporta como análogo estructural de la D-alanina, por lo que inhibe la actuación de la racemasa que convierte la L-ala a D-ala, así como de la reacción de unión de dos D-ala.
3.Tunicamicina: inhibe la traslocasa que cede el NAM unido hasta entonces al UDP y lo pasa al bactoprenol (fase 2ª).
4.Vancomicina y ristocetina: inhiben la segunda transglucosidación (fase 3ª), es decir, la unión de diversas unidades disacarídicas.
5.Bacitracina: se une al undecaprenol-pirofosfato, bloqueando su desfosforilación, e impidiendo por lo tanto, la regeneración del transportador de membrana.
6.Antibióticos ß-lactámicos (p. ej.: penicilinas, cefalosporinas): inhiben la reacción de entrecruzamiento por transpeptidación. (Estudiaremos su mecanismo de acción en más detalle en el capítulo 20 sobre Quimioterápicos y Antibióticos).
3 CRECIMIENTO DE LA PARED CELULAR
Como ya dijimos al comienzo de este tema, aunque la pared celular es una estructura cerrada y sin solución de continuidad, debe permitir su expansión (crecimiento), y esto supone que se han de romper ciertos enlaces si se quiere que el nuevo material se ensamble con el preexistente mediante nuevas uniones, es decir, debe existir una acción concertada de mureín-hidrolasas y de mureín-sintasas. Por otro lado, hay que tener en cuenta que en el crecimiento de la pared celular se producen dos tipos de procesos: la expansión (aumento de tamaño) de esa pared, y la formación del tabique transversal en el centro de la célula.
El crecimiento y septación del peptidoglucano están basados en la actividad controlada y localizada en puntos determinados, de una gama de autolisinas, especialmente las dotadas de actividad transglucosidasa y/o transpeptidasa. Debido a que estas enzimas son los sitios de acción de las penicilinas (y otros antibióticos ß-lactámicos), se les conoce también con el nombre de PBP (de penicillin-binding proteins; véase la tabla 1).
3.1 CRECIMIENTO DE LA PARED EN UNA BACTERIA GRAM-NEGATIVA: Escherichia coli
El crecimiento de la pared en E. coli se puede considerar dividido en dos fases:
1. Crecimiento en longitud (elongación), mientras la célula crece en tamaño.
2. Producción del tabique transversal (septación), que conduce a la formación de dos células hijas.
Elongación
Las PBPs 1 son las encargadas de la elongación de las cadenas de PG naciente (por transglucosidación de las unidades disacarídicas) y simultáneamente, por transpeptidación, logran el entrecruzamiento.
Las cadenas nacientes del PG se intercalan en la parte cilíndrica del sáculo de PG gracias a que las PBP4 y PBP5 cortan enlaces del PG preexistente. La PBP2 interviene aquí también para transpeptidación. La cadena de PG se va elongando unidireccionalmente alrededor de la circunferencia de la célula. Se calcula que existen unos 200 sitios de inserción de nuevo material en cada célula, dispersos de forma más o menos uniforme por toda la superficie de la célula. La maquinaria biosintética tarda 8 minutos en completar cada circunferencia de elongación.
Formación del tabique transversal
La división de la bacteria por fisión binaria simétrica se logra por medio de una invaginación circular de las envueltas (membrana citoplásmica y peptidoglucano) en mitad de la célula madre. En el inicio de este proceso tiene un papel esencial la proteína FtsZ, y más tarde intervienen otras proteínas Fts.
FtsZ es una proteína imprescindible, presente tanto en eubacterias como en arqueas, que muestra parecido con las tubulinas eucarióticas. Al parecer, al igual que las tubulinas, la FtsZ se une a GTP, con lo que se promueve su polimerización. Bajo control del ciclo celular, la FtsZ se ensambla poco antes de la división en el centro de la célula, formando un “anillo citocinético” en el lado citoplásmico de la membrana celular. Existen indicios fuertes de que la formación de este anillo de FtsZ señaliza el sitio por donde se producirá la división y se activará el crecimiento del peptidoglucano del tabique transversal. Una vez que FtsZ ocupa el lugar del futuro septo, entran en acción otras proteínas Fts, formando un complejo llamado “divisoma”.
En las fotografías a microscopio electrónico se ve cómo bajo la invaginación de membrana que constituye la “avanzadilla” del septo, se localizan las moléculas de FtsZ.
La hipótesis señala que los polímeros de FtsZ se van “contrayendo”, de modo que “tiran” de las envueltas hacia el interior, provocando la típica invaginación alrededor del centro del bacilo, y que simultáneamente, la FtsZ provoca la activación de la PBP3 (=FtsI), que es una transglucosidasa/transpeptidasa específica del tabique transversal.
A microscopio electrónico se observa que este tabique está formado por dos láminas de PG (densas a los electrones) separadas entre sí por otra transparente. El final de la división ocurre como consecuencia de la invaginación de la membrana externa entre las dos láminas de PG.
¿Cómo se ensambla la membrana externa con relación al PG? Parece ser que esta membrana se ensambla en buena medida por procesos espontáneos guiados por interacciones entre el LPS y proteínas, sirviendo el PG subyacente como andamio que facilita el montaje de toda la estructura. Parece ser que las zonas de adhesión (junturas de Bayer) son importantes para la correcta colocación de LPS y proteínas de la membrana externa.

3.2 CRECIMIENTO Y SEPTACIÓN EN UNA BACTERIA GRAM-POSITIVA: Enterococcus faecalis
A diferencia de lo visto en E. coli, en el enterococo (Enterococcus faecalis) el crecimiento del PG no es difuso, sino zonal, comenzando en el centro (zona ecuatorial) y avanzando hacia afuera.
Véase en la figura el experimento de marcado de pared celular con anticuerpos fluorescentes, con ulterior seguimiento del marcaje al microscopio:
tras unos 15 minutos después del marcado se observa que existe una banda ecuatorial oscura (no marcada, por lo tanto está constituida por material nuevo recién insertado), mientras que los polos de las células siguen enteramente marcados.
Tras 30 o 60 minutos observamos células enteramente sin marcar, intercaladas entre células con uno de sus polos marcados.
El proceso se puede describir así:
1.En la célula adulta antes de la división aparece una banda ecuatorial donde la pared celular se hace más gruesa.
2.Debajo de esta zona engrosada (hacia el interior del citoplasma) se va depositando nuevo material, lo que marca el inicio de la formación del tabique transversal. Enseguida aparece una muesca en la banda ecuatorial.
3.El tabique, con un grosor doble al de la pared celular de la superficie celular, sigue avanzando, hasta que...
4.Se completa. Simultáneamente a los pasos 3º y 4º la zona de nueva síntesis de P.C. superficial alcanza el ecuador de las celúlas hijas nacientes.
5.El tabique completo de doble grosor va siendo escindido en dos mitades desde el exterior hacia el centro, por acción de autolisinas. De esta forma se le adjudica a cada célula hija la nueva pared correspondiente a uno de sus polos (el otro procede, intacto, de la célula madre).
Véase igualmente la figura que muestra en más detalle la formación del tabique. La idea que se saca del proceso en esta bacteria es que posee una sola zona de crecimiento de PG, con dos regiones de deposición de nuevo material: la región del tabique transversal propiamente dicho, y la región adyacente, ya en la superficie celular, responsable de la expansión de la pared periférica, a ambos lados del tabique.
4 PROTOPLASTOS Y ESFEROPLASTOS
Mediante procedimientos de laboratario se puede lograr eliminar total o parcialmente la pared celular bacteriana. Se denominan protoplastos las células bacterianas a las que se ha desprovisto totalmente de pared celular, mientras que esferoplastos son aquellas células bacterianas que poseen restos de pared.
Obtención. Existen dos posibles métodos alternativos:
1.Por destrucción del entramado del PG mediante enzimas líticas (lisozima, peptidasas). En el caso de bacterias Gram-negativas, previamente hay que desorganizar la membrana externa para hacerla permeable a estas enzimas. Ello se logra usando el quelante EDTA y/o sometiendo las células a bajas temperaturas.
2.Por inhibición de la formación de nuevo PG en las células en crecimiento, tratándolas p. ej., con penicilina. Si se parte de un mutante auxotrofo para un componente del PG basta hacer crecer a la bacteria en un medio carente de dicho componente.
Estos métodos permiten:
en el caso de Gram-positivas, la desorganización total de su pared, por lo que se obtienen protoplastos;en el caso de las Gram-negativas, quedan restos de membrana externa y de peptidoglucano atrapados en ella, por lo que se obtienen esferoplastos.
En ambos casos, protoplastos y esferoplastos pueden revertir a la forma normal eliminando el tratamiento (retirando la lisozima, o la penicilina).
Protoplastos y esferoplastos son formas osmóticamente sensibles debido precisamente a que al no existir o estar desorganizado parcialmente el PG, ya no se pueden contrarrestar las fuerzas de presión osmótica existentes en los medios hipotónicos en que normalmente se cultivan o suspenden las bacterias. Por lo tanto, si se quieren obtener suspensiones estables de estas formas, hay que obtenerlas en medios o soluciones isotónicos o ligeramente hipertónicos, para evitar su lisis:
soluciones de NaCl 0,25-0,5 M;
sorbitol o sacarosa 0,1-0,5 M;
polietilénglicol (PEG) al 7,5%.
En estos medios los protoplastos y esferoplastos poseen formas esféricas, independientemente de la forma que tuviera la bacteria con pared de que proceden.
Se emplean en varios aspectos de investigación básica:
método suave para luego obtener extractos libres de células y fracciones subcelulares.
en algunas bacterias, método para hacerlas permeables al ADN, en experimentos de transformación genética.
para realizar fusión entre protoplastos de diferentes cepas de la misma especie e incluso entre especies distintas. Se trata de un método de obtención de “recombinantes somáticos” usado para determinados estudios genéticos en bacterias que no tengan sistemas naturales de transferencia genética.
5 FORMAS L
Son células bacterianas carentes total o casi totalmente de P.C., con formas pleomórficas, irregulares y globulares, que se producen de forma espontánea en algunas especies bacterianas (p. ej., Streptobacillus moniliformis) cuando se cultivan en medios a base de suero (que son hipertónicos).
Las colonias de las formas L naturales son muy características: en “huevo frito”, bifásicas.
Se pueden obtener de forma inducida formas L en diversas bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, tratándolas con penicilina en medios hipertónicos.
Las formas L inestables se generan por tratamientos breves, y pueden revertir con frecuencia a la forma normal con pared. Poseen algo de PG, aunque éste se encuentra alterado respecto al PG de la célula normal.
Las formas L estables se producen por tratamientos más prolongados, y no suelen revertir al tipo normal. La mayoría carecen totalmente de peptidoglucano.
Así pues, en las formas L el peptidoglucano ha sido eliminado total o parcialmente, pero de manera que ya no puede servir de aceptor de nuevo PG.

BIBLIOGRAFÍACAPÍTULOS DE LIBROS DE REFERENCIA
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ARTÍCULOS DE REVISIÓN
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Antibiotics May Not Be Needed After Abscess Incision and Drainage

News Author: Karla Gale, MS
CME Author: Penny Murata, MD
Authors and Disclosures
CME Released: 04/09/2010; Valid for credit through 04/09/2011
April 9, 2010 — Antibiotics don't improve outcomes after incision and drainage of uncomplicated skin abscesses, new research indicates. They might prevent new abscesses at one month, however.
"We're seeing so many abscesses now," lead researcher Dr. Gillian R. Schmitz told Reuters Health. Before methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) became so widespread, most abscess patients had diabetes or were immunocompromised, she said, "but now they're popping up all over the place in people with no traditional risk factors."
"But no one has studied best practice for treating abscesses," Dr. Schmitz added.
In a multicenter trial, she and her colleagues randomized 212 adults to receive trimethoprim-sulfamethoxazole (160 mg/800 mg) or placebo after incision and drainage of community-acquired abscesses. They instructed patients to take 2 pills twice daily for seven days. The primary outcome was treatment failure at 7 days, defined as no improvement after 2 days, development of a new separate abscess within 7 days, or worsening infection within 7 days requiring intervention.
Eighty-eight patients in the antibiotic group and 102 in the placebo group completed 7 days of follow-up; 46 and 50, respectively, returned at 30 days.
According to their March 29th online report in the Annals of Emergency Medicine, all bacterial isolates were uniformly sensitive to trimethoprim-sulfamethoxazole. Still, there was no significant difference in treatment failure rates at 7 days (17% in the antibiotic group and 26% in the placebo group, p = 0.12).
"Antibiotics don't help with resolution of infection," Dr. Schmitz said. "The most important thing is to open the wound, clean it, and get the pus out."
However, the total number of new lesions at 30 days was significantly lower in the antibiotic group: 9% vs 28% (p = 0.02).
"More study needs to be done to draw a conclusion about recurrence, because we lost so many to follow-up at 30 days," Dr. Schmitz said.
A separate trial in children with community-acquired skin abscesses found similar results. In a paper scheduled for print publication in the May issue of same journal, Dr. Myto Duong, currently at Southern Illinois University, Springfield, and associates report outcomes in 149 children after incision and drainage. The 73 children randomized to the intervention group took trimethoprim-sulfamethoxazole for 10 days (10-12 mg trimethoprim/kg/day in 2 divided doses, with a maximum of 160 mg per dose, in a liquid formulation containing 200 mg sulfamethoxazole/40 mg trimethoprim per 5 mL). The other 76 children received placebo.
The authors found no significant difference in failure rates at 10 days — 4.1% in the antibiotic group vs 5.3% in the placebo group. In addition, the antibiotic group had a significantly lower incidence of new lesions at day 10 (12.9%, vs 26.4% in the placebo group).
At 30 days, however, with 46 children in the antibiotics group and 52 in the placebo group evaluable, there was no longer a significant difference in the rate of new lesions (28.3% vs 28.8%, respectively).
"Antibiotics are not required for pediatric skin abscess resolution," Dr. Duong's group concludes, adding that further research is needed to see if antibiotics help prevent new lesions in the short term.
Both studies were limited by attrition of patients and by inclusion of subjects who were otherwise healthy, so the results can't be generalized to patients with comorbidities. In Dr. Duong's trial, medication compliance was only 66%.
In an editorial, Dr. David A. Talan of Olive View--UCLA Medical Center in Sylmar, California, states, "Antibiotics for drained simple abscesses are not required to meet the standard of care."
He told Reuters Health, "The rate of resolution of patient groups described in these studies is very high, so doctors can feel that the odds are on their side" if they forego antibiotic treatment, "and they can reassure patients there's a good chance that things will work out fine."
But, he continued, physicians should be aware of the tendency for abscesses to return, and they should advise patients to seek attention if new symptoms appear after first infection resolves.
Ann Emerg Med. Published online March 29, 2010.
Reuters Health Information 2010. © 2010 Reuters Ltd.
Clinical Context
In the November 2007 issue of Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Rajendran and colleagues reported that after incision and drainage for abscess, improvement at 7 days occurred in 84% of patients receiving antibiotics and 91% of patients receiving placebo. In children with skin abscesses, rates of treatment failure were similar for those treated with trimethoprim-sulfamethoxazole vs placebo, as found by Duong and colleagues in the May 5, 2009, online issue of the Annals of Emergency Medicine.
This multicenter, double-blind, randomized, placebo-controlled trial evaluates whether treatment with trimethoprim-sulfamethoxazole for uncomplicated skin abscesses reduces treatment failure in the first 7 days and the rate of new lesion formation in the first 30 days after incision and drainage in adults.
Study Highlights
• 212 adults 16 years or older from a convenience sample of 220 adults with uncomplicated skin abscesses requiring incision and drainage were enrolled.
• 4 military emergency departments participated.
• Exclusion criteria were immunocompromised status, pregnancy, breast-feeding, allergy to sulfa drugs, fever or systemic illness, antibiotic use in the prior week, hospitalization in the prior month, abscess on the face, suspected tracts or fistulas, and need for drainage in the operating room.
• Standard practice was used to drain and pack abscesses.
• Incision length, irrigation, and ultrasonography use were dependent on the individual physician.
• Wound cultures were sent for aerobic and anaerobic cultures and antimicrobial susceptibility testing.
• 96 patients were randomly assigned to receive trimethoprim-sulfamethoxazole (160 mg/800 mg) 2 pills twice daily for 7 days.
• 116 patients were randomly assigned to receive placebo.
• The placebo group vs the trimethoprim-sulfamethoxazole group had similar baseline characteristics of age (range, 17 - 79 years), sex, abscess location, cellulitis size, and abscess size.
• The most common abscess location was an extremity (47% - 49%).
• Patients were asked to follow up in the emergency department at 2 days and again at 7 days for wound check.
• Primary outcome measure was treatment failure within 7 days.
• Treatment failure in 7 days was defined as no improvement after 2 days, new separate lesion within 7 days, or worsening infection within 7 days requiring intervention (increased diameter of abscess, cellulitis, fever, or systemic response requiring further antibiotic use, additional incision and drainage, surgical debridement, or hospital admission).
• Secondary outcome measure was formation of new lesions, abscess, or pustule within 30 days.
• 3 sites assessed secondary outcome by telephone calls, return visits to the emergency department, and review of medical records.
• Culture results revealed MRSA in 53% of patients overall: 47 (47%) of 100 patients in the placebo group and 50 (60%) of 84 patients in the trimethoprim-sulfamethoxazole group.
• All MRSA isolates were sensitive to trimethoprim-sulfamethoxazole.
• At 7-day follow-up of 190 (90%) of 212 subjects, the treatment failure rate was statistically similar for the placebo group (27 [26%] of 102 patients) vs the trimethoprim-sulfamethoxazole group (15 [17%] of 88 patients). The difference was 9% (P = .12).
• At 30-day follow-up of 96 (69%) of 139 subjects, new lesion formation was greater in the placebo group (14 [28%] of 50 patients) vs the trimethoprim-sulfamethoxazole group (4 [9%] of 46 patients). The difference was 19% (P = .02).
• Adverse effects were reported by 10 patients in the trimethoprim-sulfamethoxazole group: 4 had nausea, 3 were drowsy or dizzy, 1 had headache and night sweats, 1 had vaginal yeast infection, and 1 had mild allergic reaction.
• 1 patient in the placebo group reported an adverse effect of drowsiness.
• Limitations of the study were loss to follow-up, convenience sample, inability to generalize to children or to persons with compromised immune systems, and lack of standardization of incision-and-drainage technique.
Clinical Implications
• In adults with uncomplicated skin abscesses, trimethoprim-sulfamethoxazole does not decrease treatment failure at 7 days after incision and drainage.
• In adults with uncomplicated skin abscesses, trimethoprim-sulfamethoxazole might decrease the formation of new lesions at 30 days after incision and drainage

Desvelan como las bacterias controlan su desplazamiento en enjambre

Una investigación, liderada por investigadores de la Universidad Autónoma de Barcelona (UAB), ha descrito uno de los mecanismos por el cual las poblaciones de bacterias patógenas controlan su dispersión por la superficie de los órganos que infectan, deteniéndose ante la presencia de un antibiótico y retomando su actividad cuando este disminuye. El proceso tiene como protagonista a la proteína recargo, que aumenta significativamente su concentración cuando se pone en marcha el mecanismo de reparación del material genético de las bacterias, desencadenado por los antibióticos. La investigación ha sido publicada en Infection and Immunity.
Para desarrollar su proceso infeccioso, muchos patógenos bacterianos se desplazan colectivamente por encima de la superficie del órgano que infectan, facilitando su colonización masiva, con la consiguiente producción de toxinas y sustancias que lesionan los tejidos del huésped. Este desplazamiento se llama movimiento en enjambre, - "swarming" en inglés-, y es similar al de los enjambres de abejas y otros animales. Algunos datos sobre el proceso molecular asociado a este desplazamiento ya habían sido descritos, pero no se conocían los mecanismos que controlaban su activación o inhibición.
En el trabajo publicado se desvela por primera vez la relación entre el mecanismo de reparación del material genético de las bacterias, llamado respuesta SOS, y el movimiento en enjambre. Los investigadores han comprobado que la presencia del antibiótico activa la respuesta SOS, aumentando la concentración de la proteína recargo. Esta proteína interfiere en la acción de la proteína Chew, implicada en el movimiento en enjambre y, como consecuencia, se detiene el movimiento poblacional. Cuando la concentración del antibiótico disminuye, la cantidad de la proteína recargo se reduce y Chew tiene de nuevo el camino libre para seguir promoviendo la dispersión de la población bacteriana.
Afectación al exterior del enjambre
Los resultados obtenidos indican que, dadas las características especiales de este tipo de movimiento colectivo, los antibióticos sólo afectarían las células del exterior del enjambre, que actuarían como sensores de la presencia del antibiótico, activando el mecanismo molecular mencionado anteriormente y evitando, así, el efecto del fármaco sobre el resto de la población bacteriana.
Los investigadores del Departamento de Genética y de Microbiología de la UAB, Jordi Barbé, Laura Medina Ruiz y Susana Campoy, que han encabezado la investigación, destacan la importancia de este descubrimiento básico, ya que puede permitir diseñar dianas que bloqueen la acción de recargo y aumentar la sensibilidad de las bacterias a los antibióticos.
La investigación se ha llevado a cabo en Salmonella enterica, miembro de un grupo bacteriano al que pertenecen numerosas especies patógenas que causan enfermedades de los sistemas digestivo y respiratorio, así como sepsis e infecciones sistémicas.
En colaboración con los investigadores de la UAB, han participado los investigadores Cristina Latasa, del Instituto de Agrobiotecnología-Universidad Pública de Navarra-CSIC-Gobierno de Navarra-y Paula Cárdenas y Juan Carlos Alonso, del Centro Nacional de Biotecnología del CSIC.


Infection and Immunity (July 2010), p. , Vol. 78, No. 7

Estudio muestra que palomas son fuente de bacterias dañinas

22 de junio de 2010, 12:37 PM
Por Kate Kelland
LONDRES (Reuters) - Un equipo de científicos identificó que las palomas, que dominan las plazas de las ciudades de todo el mundo y gozan de mala fama, transportan dos bacterias causantes de enfermedades, lo que las convierte en una amenaza para la salud pública.
Los resultados del estudio en España mostraron que pese a que estos microorganismos pueden ser dañinos para los humanos, aparentemente no causan problemas a las aves. Por lo tanto las palomas, que a menudo son llamadas "ratas con alas", pueden actuar como fuentes de peligrosas bacterias.
"Los animales que viven en contacto cercano con los humanos pueden ser riesgosas reservas de patógenos humanos", escribió Fernando Esperon, del Centro de Investigación de Salud Animal en Madrid, que lideró el estudio.
Las personas que habitan de Londres a Venecia y de Nueva York a San Francisco tienden a tener una relación de amor y odio con los millones de palomas urbanas que dominan las plazas, bares y monumentos de sus ciudades.
Sus desechos cubren la Plaza Trafalgar, en Londres; la Plaza San Marcos, en Venecia, y Times Square, en Nueva York, donde picotean sin cesar las migas que quedan de la comida.
Para este estudio, que fue publicado en la revista BioMed Central del Acta Veterinaria Scandinavica, Esperon y su equipo analizaron 118 palomas de áreas urbanas de la capital española para detectar la prevalencia de ciertas bacterias conocidas como portadoras de enfermedades en los humanos.
Los investigadores hallaron una bacteria llamada Chlamydophila psittaci en el 52,6 por ciento de las aves capturadas, y otra llamada Campylobacter jejuni en el 69,1 por ciento.
En los humanos, la psitacosis a menudo comienza con síntomas gripales y se puede convertir en una neumonía peligrosa para la vida. Y, de acuerdo a Esperon, la bacteria de la especie campylobacter es una de las principales causas de diarrea aguda en todo el mundo.
"De hecho, en muchos países, como Inglaterra y Gales, Canadá, Australia y Nueva Zelanda, la infección de Campylobacter jejuni provoca más casos de diarrea aguda que la infección con las especies de salmonella", escribió.
Al igual que otras bacterias, la salmonella también puede causar fiebre, diarrea, náuseas y vómitos.
Los científicos dijeron que, aunque las mismas aves parecían no enfermarse con las bacterias, podrían potencialmente transmitirlas a los humanos.
"Estos datos deberían tenerse en cuenta para controlar a la población de palomas", escribió el equipo.

Venta de antibióticos sólo bajo prescripción médica - México

Las autoridades prometen que, ahora sí, harán cumplir lo que la ley establece desde hace años: obligar a las farmacias a vender medicamentos sólo bajo prescripción médica. Los especialistas no auguran éxito a una medida planteada de forma aislada.

Esta vez la lucha que los altos funcionarios de salubridad darán no es para enfrentar un virus de oscuro origen, sino contra los hábitos arraigados en la población que tienen que ver con el libre consumo de medicamentos. La idea es evitar que las bacterias sigan volviéndose resistentes a los antibióticos, debido al uso abusivo de éstos.

Para lograrlo, la prescripción es tan simple que despierta el escepticismo de especialistas: las farmacias ya no deben vender, salvo contadas excepciones, antibióticos sin receta; algo que la Ley General de Salud ordena desde hace años.

Dado que las herramientas de supervisión necesarias y una campaña paralela de sensibilización sobre su importancia brillan por su ausencia, la medida parece una aspirina administrada a un paciente que requiere cirugía mayor. Al conseguir que la ley se acate, México formaría parte de un reducido grupo de países latinoamericanos que ya restringen la venta de antibióticos, integrado por Chile, Costa Rica, Perú y Venezuela.

Pero lograrlo no será fácil: las oficinas estatales de la Comisión Federal de Protección contra Riesgos Sanitarios (Cofepris) no se dan abasto para supervisar a las más de 20,000 farmacias del país.

Las consecuencias de este enorme desafío en términos de supervisión son evidentes. Si bien a partir de abril su venta quedaría restringida, esto no ha sucedido. En el país el mercado de antibióticos vale cerca de 1,000 millones de dólares anuales y estos medicamentos representan el segundo lugar de sus ventas.

Sin embargo, las autoridades tienen motivos para limitar su uso: sin indicación médica estos fármacos contribuyen a que las bacterias resistan la acción de los antibióticos. Los cálculos varían respecto a cuántos de estos fármacos se venden sin prescripción médica. El Instituto Nacional de Salud Pública (INSP) calcula que 40%.

Pero el problema de salud pública que representa la resistencia microbiana y sus causas son mucho más complejos que las cifras de la venta libre de antibióticos. De acuerdo con el INSP, alrededor de 70% de los pacientes con infecciones respiratorias y diarreicas agudas reciben recetas de antibióticos, cuando su uso se justifica sólo entre 10% y 15% de los casos.

La promoción del uso racional de medicamentos por parte de la Organización Mundial de la Salud data de los 80. Basada en la experiencia internacional, "una medida aislada está condenada al fracaso", dice Anahí Dreser, investigadora del INSP y especialista en políticas de medicamentos.

Más info en el sitio web de Instituto Nacional de Salud Pública de México


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